Correggere in maniera sempre più efficiente, e permanente, il difetto genetico alla base della grave patologia muscolare. Obiettivo raggiunto da due studi preclinici, uno statunitense e l’altro tedesco
Da diversi anni la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è entrata nel mirino di CRISPR, l’ormai noto sistema di editing genomico che ambisce a combattere le malattie genetiche puntando alla correzione dei difetti presenti nel DNA. Una serie di studi hanno finora dimostrato la capacità di Crispr-Cas9 di correggere alcune mutazioni alla base della DMD, ma il grado di efficienza e l’effetto a lungo termine sono ancora un tallone di Achille. Ed è su questi aspetti che sono interessanti i risultati dei due nuovi studi. Il primo, statunitense, e condotto su topi, ha dimostrato che CRISPR è in grado di colpire le cellule staminali muscolare rendendo così la correzione permanente. Nel secondo studio, ricercatori tedeschi sono riusciti a correggere con una buona efficienza le cellule muscolari e cardiache in un modello animale più vicino all’uomo sulla scala filogenetica: il maiale.
Le strategie terapeutiche per combattere la Duchenne
La Duchenne è la più conosciuta e grave tra le forme di distrofia muscolare, colpisce quasi esclusivamente individui di sesso maschile (con un’incidenza di 1 su 5000 nati vivi) e conduce ad una progressiva e inarrestabile degenerazione muscolare. La DMD è causata da mutazioni nel gene della distrofina che determinano l’assenza della proteina omonima, proteina essenziale per il corretto funzionamento dei muscoli. Allo stato attuale questa malattia rara non ha una cura risolutiva ma esistono diversi filoni di ricerca dai quali si spera possano presto emergere possibili soluzioni di trattamento. Tra le strategie che mirano a correggere, od “ovviare”, il difetto genetico vi sono: ataluren (unico farmaco specifico attualmente approvato in Europa e in Italia per la Duchenne, ideato per specifiche mutazioni chiamate “nonsenso”), gli oligonucleotidi antisenso che si stanno rivelando piuttosto incisivi nel ripristino della produzione di distrofina, la terapia genica che sta dando risultati incoraggianti in tre diverse sperimentazioni cliniche e la tecnica di editing genomico, che è ancora in fase preclinica ma su cui ricadono molte aspettative. Ed è proprio sulla strategia basata sul sistema CRISPR che le ultime pubblicazioni scientifiche si fanno sempre più interessanti.
Lo studio americano
Uno studio pubblicato lo scorso luglio sulla rivista Molecular Therapy, condotto in modelli murini, ha dimostrato la possibilità di veicolare il sistema di editing genomico Crispr-Cas9, con uno dei più sfruttati vettori virali per la Duchenne (AAV9), direttamente nelle cellule staminali muscolari e di correggere in loco la mutazione genetica alla base della DMD. Il risultato - ottenuto dalla collaborazione di gruppi di ricerca dell’Università del Missouri, della John Hopkins School of Medicine e della Duke University - è molto importante perché vuol dire riuscire a correggere la mutazione in maniera permanente. Le cellule staminali muscolari sono infatti le cellule responsabili della rigenerazione muscolare, “se possiamo correggere la mutazione nelle cellule staminali muscolari, le cellule rigenerate da queste non porteranno più la mutazione”, ha commentato Dongsheng Duan, autore dello studio e pioniere nella ricerca preclinica dell’editing genomico applicato alla Duchenne. “Il trattamento delle cellule staminali muscolari con CRISPR potrebbe quindi determinare un’espressione continua della distrofina nelle cellule muscolari rigenerate.”
Negli ultimi anni, diversi studi hanno utilizzato virus adeno-associati (AAV) per veicolare Crispr-Cas9 all’interno delle cellule muscolari dimostrando, sia in modelli murini che in un modello canino, che Cas9 e l'RNA guida (gRNA), i due componenti del sistema CRISPR, sono in grado di correggere le mutazioni nel gene della distrofina, ripristinare l'espressione della distrofina e migliorare la funzione muscolare e cardiaca. Ma è la prima volta che ciò avviene nelle cellule staminali muscolari.
I ricercatori hanno studiato la possibilità che l’espressione di distrofina si mantenesse nelle cellule rigenerate e lo hanno fatto confrontando i risultati sul muscolo sano e su quello malato. Per iniziare, mediante un approccio innovativo, il sistema CRISPR è stato veicolato dal vettore AAV9 nel tessuto muscolare di un topo sano mirando alle cellule staminali. Target arduo visto che il numero di queste cellule è veramente ridotto all’interno del tessuto muscolare. Successivamente queste cellule sono state trapiantate in un topo immunodeficiente ed è stato osservato che il muscolo trapiantato andava prima in necrosi e poi si rigenerava dalle sue stesse cellule trattate geneticamente. Ciò significa che il vettore AAV9 era stato perfettamente in grado di portare Crispr-Cas9 all’interno delle cellule staminali muscolari, le quali, una volta trapiantate, avevano contribuito alla rigenerazione muscolare. A questo punto, il team ha ripetuto l’esperimento su un topo modello per la distrofia di Duchenne ed è stato osservato che anche in questo caso le cellule staminali nel muscolo malato sono state modificate con successo: le cellule rigenerate, infatti, sono riuscite a produrre la distrofina. I ricercatori hanno anche svolto le dovute verifiche per escludere che tale espressione fosse dovuta ad altre cause (ad esempio l’influenza delle cellule dell’ospite) trovando conferma dell’efficacia del loro protocollo. “Questa scoperta suggerisce che CRISPR rappresenta uno strumento importante per la correzione permanente della mutazione genetica nella DMD e, potenzialmente, per altre malattie muscolari”, ha commentato Duan.
Lo studio tedesco
In uno studio più recente, pubblicato lo scorso 27 gennaio sulla prestigiosa rivista Nature Medicine, un gruppo di ricerca interdisciplinare, composto da ricercatori della Technical University of Munich (TUM), della Ludwig Maximilian University of Munich (LMU) e del German Research Center for Environmental Health (Helmholtz Zentrum München), è riuscito a correggere il gene mutato della distrofina in un modello di suino. Come si può leggere nell’articolo, i ricercatori hanno modificato il sistema di editing genomico Crispr-Cas9 per renderlo più efficiente e adatto a correggere la sequenza genetica difettosa delle cellule muscolari e cardiache in un modello di maiale per la Duchenne. Anche in questo studio Crisp-Cas9 è stato veicolato nelle cellule tramite il vettore virale AAV9, dove è stato in grado di modificare il gene della distrofina favorendo la sintesi di una versione più corta ma ugualmente stabile della proteina che ha garantito un miglioramento della funzionalità muscolare. A livello clinico, i maiali hanno mostrato una ridotta suscettibilità all’aritmia cardiaca, tipica della patologia, e un aumentando dell’aspettativa di vita.
Due sono i vantaggi di questo approccio: il primo è che, come ha commentato Christian Kupatt, cardiologo dellaTUM, "le cellule cardiache sono strutture cellulari di lunga durata. La metà di tutte le cellule del miocardio rimane funzionale dalla nascita durante l'intero ciclo di vita di un essere umano. Il genoma di una cellula viene utilizzato per la biosintesi delle proteine fintanto che la cellula è in vita, e una volta che una cellula è stata colpita dalla terapia, rimane corretta". Il che depone a favore degli effetti a lungo termine di questa strategia terapeutica sperimentale. Il secondo è che gli scienziati tedeschi hanno impiegato un modello animale di suino, molto più vicino sulla scala filogenetica all’uomo rispetto al topo e al cane. È noto in campo biomedico che la morfologia e la dimensione degli organi, in particolar modo del cuore, e la fisiologia dei maiali sono molto simili a quelle umane. Uno studio preclinico che fa quindi un passo in più verso l’uomo.
È importante sottolineare che si tratta di ricerca ancora in fase preclinica ed è quindi prematuro pensare ad un’applicazione sull’uomo. Ma con questi due studi sono stati aggiunti nuovi importanti tasselli sul fronte della conoscenza delle potenzialità di CRISPR sul tessuto muscolare, conoscenze fondamentali per poter implementare e affinare le armi nella battaglia contro la distrofia muscolare di Duchenne e altre patologie neuromuscolari.
