L’editing genomico è in via di sviluppo preclinico per la DMD. Due recenti studi hanno aggiunto nuovi importanti tasselli.

I ricercatori della Duke University hanno dimostrato che un singolo trattamento di editing genomico con CRISPR può correggere la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) in modo sicuro e stabile per più di un anno nei topi, nonostante ci siano state risposte immunitarie e modifiche non previste sul DNA. In un altro studio, firmato dai ricercatori della University of Texas Southwestern Medical Center, CRISPR è stato usato per correggere una mutazione caratteristica nella DMD, la delezione dell’esone 44, in modelli murini e in cellule umane.

La DMD è una malattia neuromuscolare causata da mutazioni nel gene della distrofina, una grossa proteina localizzata sulla superficie delle cellule muscolari, dove collabora con altre proteine per il corretto funzionamento della fibra muscolare. Il gene della distrofina contiene 79 regioni codificanti (esoni): quando una o più di queste regioni viene interrotta o eliminata da una mutazione, la catena proteica non si forma e questo provoca la degenerazione del tessuto muscolare, caratteristica della malattia. La Duchenne è la più grave tra le distrofie muscolari, colpisce tutti i muscoli del corpo compresi i muscoli respiratori e il cuore, e ad oggi non esiste una cura.

Charles Gersbach, Professore di ingegneria biomedica alla Duke University e autore dello studio pubblicato su Nature Medicine a febbraio 2019, è un pioniere nell’utilizzo di CRISPR nell’ambito della DMD. Il suo approccio prevede l’utilizzo di CRISPR per eliminare l’esone che contiene la mutazione genetica, lasciando al sistema cellulare di riparazione del DNA la possibilità di ricucire il gene in maniera tale da creare una versione della distrofina più corta, ma funzionale. Per veicolare il sistema CRISPR-Cas9 all’interno delle cellule sono stati utilizzati virus adeno-associati (AAV), vettori già utilizzati per strategie di terapia genica o di editing genomico. Lo studio ha dimostrato che l’editing genomico può ripristinare l’espressione della distrofina nei modelli murini, con un miglioramento della funzione muscolare scheletrica. Il potenziale di questa tecnologia risiede nel fatto che una unica somministrazione potrebbe avere benefici terapeutici per tutta la vita. Tuttavia, gli studi precedenti si erano focalizzati sull’efficacia a breve termine e la concentrazione di distrofina era stata valutata a 4-8 settimane dopo il trattamento. In questo caso, i topi sono stati trattati con 2 AAV, uno per Cas9 e uno per 2 RNA guide, che avevano come obiettivo l’escissione dell’esone 23 dal gene della distrofina per il ripristino dell’espressione della proteina. Gli esperimenti sono stati condotti sia su topi adulti che su topi nati da 2 giorni, entrambi portatori del gene difettoso. Nel corso dei 12 mesi seguenti è stato misurato il numero di cellule muscolari modificate con successo e quali alterazioni genetiche erano state apportate, oltre alla generazione di qualsiasi tipo di risposta immunitaria. Sono state osservate risposte immunitarie nei topi adulti, ma in nessun caso sembra aver causato tossicità o impedito al sistema CRISPR di effettuare la modifica genetica. Nei topi nati da 2 giorni non è stata rilevata alcuna risposta immunitaria e l’editing è rimasto stabile nel corso dell’anno. Pur consapevoli delle differenze tra il sistema immunitario del topo e dell’essere umano, questo ha fatto riflettere i ricercatori sulla possibilità di somministrare la terapia ai neonati come metodo per aggirare una risposta immunitaria indesiderata. Attualmente, per la Duchenne non è disponibile lo screening neonatale e la maggior parte delle diagnosi viene effettuata intorno ai 3-5 anni. Si potrebbe pensare di sopprimere il sistema immunitario durante il trattamento, ma anche studiare potenziali strategie per limitare l’espressione o il rilascio di Cas9 alle sole cellule muscolari per ridurre la risposta immunitaria. È però ancora presto per parlare di sperimentazione clinica sull’uomo. I risultati dello studio sono buoni, ma l’attenzione alla risposta immunitaria è fondamentale, soprattutto in modelli animali più grandi.

In parallelo, alla University of Texas Southwestern Medical Center, il gruppo di ricerca diretto da Eric Olson – altro nome di eccellenza nell’ambito CRISPR e Duchenne – ha puntato a correggere le mutazioni di delezione dell’esone 44 alla base della malattia, con un approccio simile a quello precedentemente descritto. Lo studio, condotto su modelli murini e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) di pazienti affetti da DMD, è stato pubblicato su Science Advances a inizio marzo. 

In linea teorica, la delezione dell’esone 44 può essere corretta nel 12% dei pazienti Duchenne ricorrendo all’escissione degli esoni vicini, il 43 e il 45. A questo scopo, i ricercatori hanno quindi utilizzato il sistema CRISPR, anche in questo caso usando un AAV come vettore di trasporto. La tecnica si è dimostrata efficace nel correggere il gene e ricostituire la proteina nelle cellule del muscolo cardiaco, cellule ottenute da cellule staminali di pazienti affetti da DMD con delezione dell’esone 44. Per dimostrare che questo tipo di trattamento potrebbe essere applicato anche in modelli animali, i ricercatori hanno utilizzato topi modificati geneticamente per avere una delezione simile a quella presente nelle cellule dei pazienti. I risultati hanno mostrato che a 3 settimane dal trattamento, il gene della distrofina è stato corretto e la produzione della proteina ristabilita sia nel muscolo cardiaco che in quello scheletrico. Lo studio ha testato dosaggi e RNA guide diversi per ottimizzare i risultati e ha dimostrato che la proporzione tra le quantità di Cas9 e di RNA guida influenza molto l’efficienza. Aspetto, inoltre, già analizzato recentemente da Gersbach e altri ricercatori. Anche in questo caso, l’obiettivo ultimo è quello modificare il DNA in maniera tale da avere una produzione di distrofina a lungo termine in modelli murini, per poi valutare una futura applicazione clinica.

Lo scorso anno, Olson aveva già pubblicato su Science un importante lavoro, che mostrava buoni risultati con l’utilizzo di CRISPR per recuperare la produzione di distrofina in cani naturalmente affetti da DMD con una mutazione che provoca la delezione dell’esone 50. Dopo studi promettenti su topi e cellule umane, questa era stata la prima sperimentazione sul modello canino, un passaggio molto importante dato che la patologia si manifesta con caratteristiche più simili, rispetto al topo, a quelle dell’uomo. Ci sono però alcuni limiti: mentre nel breve periodo è stato dimostrato un marcato miglioramento dei livelli di distrofina e della struttura muscolare, ancora non ci sono dati sull’efficacia a lungo termine su tutte le cellule muscolari, sia cardiache che striate. Anche le possibili risposte immunitarie a lungo termine rimangono da indagare. Il laboratorio diretto da Olson, visti i risultati delle ricerche, nel 2017 aveva ricevuto un finanziamento dall’associazione di pazienti statunitense - Duchenne Parent Project Muscular Dystrophy - per proseguire i suoi studi e valutare i possibili rischi di un’applicazione clinica sull’uomo.

Le ricerche sullo sviluppo di strategie terapeutiche che mirano a correggere mutazioni genetiche alla base della Duchenne stanno procedendo, a livello internazionale, in diversi laboratori. Molte sono focalizzate sulle mutazioni di delezione, che caratterizzano circa il 70% delle persone affette dalla patologia, ma si stanno studiando anche le mutazioni di duplicazione, che sono presenti nel 17% circa dei pazienti DMD. In entrambi i casi, CRISPR sembrerebbe essere uno strumento dalle grandi potenzialità, ma prima vanno migliorate l’efficienza e la sicurezza della tecnologia, oltre a regolamentare le sperimentazioni cliniche a livello internazionale.

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