L’RNA guida che usa il famoso sistema di editing genetico non supera la barriera mitocondriale, ma si sta cercando una soluzione per poter modificare anche il DNA contenuto negli organelli
Per chi lavora nel mondo delle biotecnologie – mediche e non solo - CRISPR fa parte della quotidianità. E, anche se non tutti lo usano direttamente in laboratorio, l’editing genetico è ormai onnipresente nella ricerca. Ma c’è un posto in cui CRISPR ancora non riesce ad arrivare: all’interno dei mitocondri, quei minuscoli organelli deputati alla produzione di energia cellulare e gli unici ad avere un DNA proprio, diverso da quello contenuto nel nucleo della cellula. Il DNA mitocondriale (mtDNA), infatti, contiene informazioni per il corretto funzionamento della cellula, ma può contenere anche mutazioni in grado di causare malattie. Proprio per questo è un obiettivo di grande interesse per chi sta cercando un approccio efficace per queste malattie. Il traguardo non è ancora stato raggiunto e la ricerca di una terapia genica mitocondriale richiederà tempo, ma diversi gruppi di ricerca stanno facendo i primi passi in questo percorso.
MITOCONDRI, DNA E MUTAZIONI
Aprendo un qualsiasi libro di biologia, quando si arriva al capitolo dedicato alla cellula animale c’è sempre un paragrafo di approfondimento dedicato ai mitocondri. Questo perché, anche se le loro origini non sono ancora perfettamente chiare, la teoria evolutiva che porta un batterio qualunque a essere inghiottito da un altro microrganismo e a diventare la centrale energetica della cellula è indubbiamente molto interessante e, in un certo senso, poetica. Un piccolo DNA circolare che codifica per 37 geni: questo è quello che resta di un organismo inglobato circa un miliardo e mezzo di anni fa. Pochi geni oggi fondamentali.
Il mtDNA è tipicamente ereditato dalla madre e ci possono essere diverse copie di DNA all’interno di ciascun mitocondrio. Rispetto al DNA nucleare è molto più soggetto a errori e ha meno possibilità di correggerli, perché i meccanismi di riparazione non sono efficienti come quelli che agiscono sul DNA del nucleo. Essendo ben protetto dalle membrane mitocondriali, non è facile trovare un approccio per modificare in modo preciso il mtDNA. Inoltre, ogni cellula contiene moltissimi mitocondri e ciascuno di essi può trasportare sia copie corrette che difettose di DNA: questo fenomeno si chiama eteroplasmia ed è il motivo per cui le malattie mitocondriali possono manifestarsi in modi diversi. Se il mtDNA mutato è tanto, allora si presenterà una sintomatologia più grave. Da qui nasce l’esigenza di correggere le copie difettose e ridurne il numero.
Diversi tentativi sono stati fatti in passato utilizzando gli strumenti di editing più classici, come le ZFN (zinc finger nucleases, nucleasi a dita di zinco) o le TALEN (transcription activator-like effector nucleases, nucleasi effettrici simili agli attivatori della trascrizione). Questi enzimi tagliano il mtDNA, che viene eliminato e poi sostituito a partire da copie sane già presenti nella cellula. Le copie contenenti difetti saranno ridotte a un livello accettabile man mano che le copie normali vengono replicate. Questo può essere applicato nel caso di eteroplasmia, come ad esempio nella sindrome di Leigh, ma non funzionerebbe per quelle malattie in cui tutte le copie sono mutate, come nel caso della neuropatia ottica ereditaria di Leber (LHON).
E DOVE NON ARRIVA CRISPR?
Dal momento della sua scoperta, CRISPR è diventato uno degli strumenti più utilizzati in laboratorio e in questi anni si è evoluto velocemente, basti pensare a base editing e prime editing. Pur avendo raggiunto traguardi prima inimmaginabili, questo approccio non ha funzionato per raggiungere e correggere il mtDNA.
I batteri hanno “donato” CRISPR alla ricerca ormai 13 anni fa (Osservatorio Terapie Avanzate lo ha raccontato nel podcast “Reshape – un viaggio nella medicina del futuro”), ma i microrganismi continuano a essere un serbatoio di strumenti utili. Nel 2018, infatti, un grande passo avanti è stato fatto con la scoperta dell’enzima batterico DddA, una deaminasi capace di convertire la base citosina in timina. Il gruppo di David Liu, uno dei “padri” di CRISPR, ha modificato l’enzima per renderlo sicuro e ha creato il primo base editor per mtDNA, che funziona senza una RNA guida, molecola tuttora impossibile da introdurre nei mitocondri. Questo ha permesso di inserire cinque mutazioni nel mtDNA in cellule umane.
Quattro anni dopo, Jin-Soo Kim e colleghi hanno sviluppato un altro editor in grado di convertire adenina in guanina (chiamato TALED, da TALE-linked deaminasi), potenzialmente in grado di correggere oltre il 40% delle mutazioni patogene note nel mtDNA. È un inizio, che dovrà proseguire con le valutazioni in termini di precisione e sicurezza delle correzioni fatte, ma anche in merito alle modalità di somministrazione più efficaci, con sperimentazioni precliniche e cliniche.
La speranza di trovare una terapia per le malattie mitocondriali è innegabile (di strategie per prevenirle ne abbiamo parlato recentemente qui), ma questi strumenti potranno essere utili anche per comprendere meglio i meccanismi che le causano, permettendo di realizzare dei modelli per studiarle. Malattie come la sindrome di Leigh e la LHON potrebbero un giorno trovare una risposta nella terapia genica mitocondriale e, pur essendo un traguardo che sembra oggi più vicino, è importante restare coi piedi per terra e avere la consapevolezza che ci vorranno anni prima di poter avviare una sperimentazione clinica.
Gemma Conroy in un articolo dedicato proprio a questo tema pubblicato su Nature a ottobre ha scritto: “CRISPR ha fatto il suo ingresso in ogni ambito della biologia moderna, ma non in ogni angolo della cellula”. Forse è già stata trovata una strada.
