Dai virus ai campi elettrici, dalle nanoparticelle alla luce: i sistemi di trasporto di CRISPR sono molteplici e, in alcuni casi, piuttosto curiosi.
Sono migliaia le malattie causate da alterazioni genetiche e solo una piccolissima parte di queste può essere trattata efficacemente. Questo ci permette di comprendere l’importanza di avere a disposizione strumenti in grado di modificare il genoma. L’editing genomico con CRISPR/Cas9 è una tecnica rivoluzionaria che si presenta come una grande promessa per il trattamento delle malattie genetiche. Tuttavia, a causa delle sue grandi dimensioni, l’efficienza di trasferimento di CRISPR/Cas9 è ancora un grosso ostacolo nel suo percorso verso l’applicazione clinica. Pertanto, lo sviluppo di nuove tecniche di trasporto è essenziale e questo ha attirato l’attenzione di numerosi gruppi di ricerca, che stanno ampliando le conoscenze in questo ambito.
CRISPR è costituita da due componenti principali: un RNA guida personalizzabile, che funziona come una sorta di bussola che indirizza il sistema verso il suo bersaglio, e la proteina Cas9, in grado di tagliare il DNA nel punto d’interesse. Cas9 può essere trasferita all’interno delle cellule in tre modi diversi, con diverse caratteristiche ciascuno: sotto forma di DNA (derivato dai batteri, a basso costo, stabile), di RNA messaggero (vantaggioso perché non richiede l’accesso al nucleo della cellula, riduce il rischio di mutazioni al di fuori del bersaglio o di integrazione nel genoma) oppure di proteina (azione diretta e veloce, elimina i rischi legati alla degradazione e all’integrazione). I ricercatori hanno esplorato diverse tipologie di vettori, virali e non, per ottenere risultati sempre migliori ed eliminare i difetti di questa tecnica, ad esempio aumentando l’efficienza, riducendo la possibile risposta immunitaria e l’inserimento di mutazioni non previste (eventi off target).
I vettori virali sono molto usati sia in vivo che in vitro perché hanno una buona efficienza e stabilità. Si utilizzano virus modificati in laboratorio in maniera tale da renderli un veicolo innocuo per la salute, i più usati sono i virus adeno-associati (AAV): negli anni è stato dimostrato che hanno un buon profilo di sicurezza, un’alta efficienza e la capacità di raggiungere molti tessuti dell’organismo. Gli AAV sono già approvati per l’utilizzo negli studi clinici e hanno dimostrato un buon potenziale terapeutico. In particolare, i virus adeno-associati sono meno immunogenici di altri virus – cioè attivano in misura ridotta il nostro sistema immunitario - e hanno solo una lieve tossicità ad alto dosaggio in modelli animali. Inoltre, gli AAV generalmente non si integrano nel genoma dell’ospite. Per quanto riguarda i difetti dell’utilizzo dei virus (non solo degli AAV, ad esempio anche i lentivirus), oltre ad avere capacità di trasporto ridotte a causa delle loro dimensioni, sono associati ad un maggior rischio di mutagenesi e carcinogenesi.
Esistono poi diverse tecniche di trasferimento “fisico” che prevedono l’indebolimento temporaneo della membrana cellulare, tra cui l’elettroporazione che permette di generare dei pori sottoponendo le cellule ad un campo elettrico. In questo caso l’efficienza è elevata, ma le cellule vengono danneggiate, la specificità è bassa e servono apparecchiature e personale altamente specializzato. Un’altra tecnica di questo tipo è la microiniezione, che permette di iniettare CRISPR direttamente nelle cellule utilizzando un ago microscopico: ha un’elevata efficienza, è controllabile e precisa, ma anche in questo caso è richiesto l’utilizzo di attrezzature professionali e ha un basso rendimento. Si possono poi utilizzare variazioni di pressione (iniezione idrodinamica) o costrizione fisica (deformazione di membrana) per creare piccoli pori per permettere il passaggio di CRISPR.
Tra le tecniche emergenti si annoverano i nanomateriali, le cui proprietà chimico-fisiche possono essere regolate per ottenere un trasporto efficace e mirato. Ad esempio, possono essere utilizzati gli esosomi, piccole vescicole naturalmente presenti nelle cellule e in grado di trasportare proteine e acidi nucleici che sono naturalmente coinvolte in molti processi cellulari. Approfondire lo studio delle caratteristiche e funzioni biologiche degli esosomi potrebbe consentire il loro utilizzo nello sviluppo di terapie avanzate, anche se hanno bassa capacità di carico. Un gruppo di ricerca di Oxford sta studiando il possibile utilizzo degli esosomi come sistema di trasporto per la terapia genica per la distrofia di Duchenne. Un’alternativa sono i liposomi, vescicole circolari simili alla membrana cellulare come composizione che sono normalmente utilizzate per il trasporto di farmaci. Sono state fatte anche sperimentazioni con sistemi ibridi esosoma-liposoma sulle cellule staminali, dato che l’ibridazione riduce i difetti dei singoli meccanismi di trasporto. Tra i nanomateriali ci sono anche le nanoparticelle di polimeri, che possono essere utilizzate per il trasporto di proteine e acidi nucleici. Un esempio sono le nanoparticelle d’oro coniugate alla proteina Cas9, che hanno avuto buoni risultati in laboratorio. Di recente, i biomateriali – come esosomi, liposomi, grafene, polipeptidi, fosforo nero, strutture metallo-organiche, etc. - sono diventati un’opzione attraente per la loro sostenibilità, biocompatibilità e per l’aumento dell’efficacia. Senza dimenticare la sicurezza: i materiali biodegradabili sono più sicuri di quelli non biodegradabili. Importante è comprendere e studiare a fondo le risposte immunitarie e le funzioni dei biomateriali che potranno guidare la progettazione di nuovi sistemi per la veicolazione di CRISPR all’interno delle cellule. Questi metodi evitano alcune insidie dei virus, ma non consentono di controllare le tempistiche di modifica dei geni.
Un’interessante variante, pubblicata di recente sulla rivista scientifica Science Advances, si basa sull’utilizzo della luce e permetterebbe ai ricercatori di avere il controllo temporale sull’intervento di editing, fattore importantissimo e ancora di difficile gestione con altri metodi. CRISPR-Cas9 è stato coniugato a delle nanoparticelle che convertono la luce utilizzando un composto chimico fotosensibile. Esponendo le cellule ad un particolare tipo (e quantità) di luce (radiazioni a bassa energia vicine agli infrarossi, NIR), gli scienziati hanno attivato il rilascio di CRISPR dalle nanoparticelle utilizzate per il trasporto alle cellule target. Questo sistema è intelligente perché, oltre ad avere il controllo sui tempi di rilascio di CRISPR, permette di agire abbastanza in profondità nel corpo e controllarlo a distanza. Le nanoparticelle fotosensibili assorbono e convertono le NIR in luce visibile ultravioletta (UV). Le NIR penetrano nel tessuto umano per raggiungere le nanoparticelle in profondità nel corpo (cosa che gli UV non possono fare) e la luce UV emessa ha la capacità di rompere le molecole sensibili alla luce, col conseguente rilascio di CRISPR nel sito di interesse. Questo studio è stato fatto su tumori in modelli murini e i risultati sono stati buoni, tanto da far sperare una futura applicazione ad altre patologie in modelli animali e, chissà, in futuro sull’uomo.
Riassumendo: i vettori virali possono essere validi, ma hanno limitazioni per quanto riguarda le dimensioni del carico che possono trasportare e qualche effetto collaterale da non sottovalutare (mutagenesi e immunogenicità). Tutto questo può limitare il loro utilizzo a terapie ex-vivo, come nel caso delle CAR-T. I vettori non virali possono espandere le possibilità attualmente disponibili, aumentare l’efficienza e la sicurezza e migliorare i trasferimenti in vivo. Le nuove tecnologie ci hanno fatto fare passi da gigante, ma resta ancora molto lavoro da fare per l’applicazione delle tecniche di editing genomico per il trattamento di diverse patologie in sicurezza e con alti livelli di efficienza. Con la speranza di poter smettere di cercare una terapia per i sintomi e trovare il modo di correggere il difetto genetico.
