Uno studio dell’Istituto SR-Tiget di Milano evidenzia come l’uso di forbici molecolari più precise potrebbe ridurre i danni innescati dal taglio del DNA
Che l’editing genomico funzioni e sia il prototipo per la medicina del futuro ormai è chiaro a tutti. Tuttavia, il principale freno al suo utilizzo è la sicurezza dei protocolli di manipolazione genetica. Oltre che efficace CRISPR è sicuro? La domanda porta con sé un dubbio amletico: può essere usato nella routine clinica oppure no?
Negli ultimi anni diversi ricercatori hanno fornito prove di efficacia della rivoluzionaria tecnologia del “taglia e cuci” molecolare ma, al contempo, non mancano gli studi che sollevano dubbi sulla sua sicurezza in ambito terapeutico. È di qualche mese fa la pubblicazione di due studi sulla prestigiosa rivista Nature Medicine che ha sollevato qualche interrogativo sugli effetti collaterali di CRISPR. Due gruppi di ricerca indipendenti, uno del Karolinska Institute in Svezia e uno dell'Università di Helsinki, avevano concluso che Crispr-Cas9 fosse in grado di mettere in moto processi cellulari che potevano aumentare il rischio di cancro. Altri recenti studi hanno suggerito lo stesso pericolo nel caso di utilizzo di CRISPR per la manipolazione genetica di cellule staminali progenitrici ematopoietiche per il trattamento di patologie genetiche del sangue come l'anemia falciforme, la talassemia e le sindromi da immunodeficienza primaria.
Ovviamente, è bastato accostare la parola “cancro” a CRISPR per generare un’ondata di paura nell’opinione pubblica. Ma prima di trarre conclusioni è obbligatorio prendere in esame la questione da tutte le angolazioni possibili. All’Istituto San Raffaele Telethon per la Terapia Genica, gli eventuali danni causati da CRISPR sono un argomento di intenso studio. Gli ultimi risultati del team milanese hanno dimostrato che l'uso di un sistema di editing genomico più preciso, che induce meno tagli nel DNA, può essere la chiave per tenere sotto controllo quelle risposte al danno che nelle cellule staminali potrebbero innescare eventi tumorali. Il lavoro è stato pubblicato oggi sulla rivista Cell Stem Cell.
I lavori pubblicati su Nature Medicine avevano messo in luce il ruolo di p53, un noto oncosoppressore la cui attivazione è collegata al danneggiamento del DNA. Se si considera come il sistema CRISPR sia programmato per tagliare la doppia elica del DNA in siti specifici non si fatica a comprendere che proprio il grande potenziale di questa tecnica rischi di diventare il suo maggiore punto debole. Perché l’evoluzione ha dotato il nostro organismo di sistemi per evitare la distruzione del materiale genetico. La proteina p53, infatti, agisce cercando di riparare le cellule danneggiate o, nei casi irrecuperabili, avviandone l’autodistruzione. Quando CRISPR entra in azione modificando la sequenza genica, taglia entrambi i filamenti di DNA in determinate posizioni. Sono proprio queste interruzioni che segnalano a p53 che qualcosa non va, spingendola ad entrare in azione per impedire alle cellule danneggiate di moltiplicarsi. Tuttavia, l’utilizzo delle cellule staminali progenitrici ematopoietiche (HPSC) nei protocolli di trattamento di patologie come l'anemia falciforme, la talassemia e le sindromi da immunodeficienza primaria prevede che le cellule modificate possano – e debbano – proliferare. Altrimenti come sarebbe possibile fare in modo che la modifica da loro espressa riesca a correggere l’errore alla base della malattia? La questione è più spinosa di quanto supposto perché pensare di disattivare p53 ed evitare questo meccanismo potrebbe condurre sulla via della cancerogenesi.
Si sa ancora troppo poco di quello che accade all’interno delle cellule staminali progenitrici ematopoietiche, coltivate in laboratorio, quando in esse si generano delle rotture nella doppia elica, pertanto i ricercatori dell’Istituto milanese hanno deciso di indagare la sequenza di eventi a livello molecolare per cercare una strategia che risolva il problema. O che, perlomeno, apra la strada alla ricerca per una soluzione. “L'editing del genoma è una strategia molto potente per una accurata manipolazione genetica delle cellule staminali, ma richiede una procedura complessa” – afferma il dott. Pietro Genovese, ricercatore presso l'Istituto Telethon San Raffaele per la terapia genica a Milano – “Nonostante l’incredibile potenziale terapeutico e i continui progressi nel perfezionamento delle piattaforme di modifica genetica, le conseguenze funzionali del processo di editing devono ancora essere completamente chiarite”.
La specificità delle nucleasi, cioè degli enzimi che eseguono il taglio, è il primo fattore correlato alla risposta al danno. Più ancora che la piattaforma di ricerca scelta (oltre a CRISPR esistono anche altri sistemi di editing genomico, come le nucleasi a dita di zinco). Se le nucleasi non sono sufficientemente specifiche, esse possono tagliare anche in siti “non autorizzati” (effetti off-target), creando danni gravi a livello sistemico. I ricercatori hanno osservato che ricorrendo a una bilanciata combinazione di nucleasi e di vettori virali (che veicolano il sistema di editing) altamente specifici, è possibile apportare una rottura nel DNA delle cellule solo nei punti desiderati, suscitando così una risposta transitoria da parte di p53.
“Abbiamo dimostrato che l'impatto delle procedure di editing genomico sulle cellule staminali progenitrici ematopoietiche dipende fortemente dalla precisione della nucleasi utilizzata” – afferma il prof. Luigi Naldini, direttore dell'Istituto San Raffaele Telethon per la Terapia Genica, tra gli autori della ricerca – “Se le nucleasi non sono estremamente specifiche e non tagliano quindi il DNA solo nel sito bersaglio, ma anche in altri siti aggiuntivi, osserviamo una risposta di p53 robusta e prolungata che suscita effetti dannosi fino all'irreversibile arresto delle funzioni delle cellule. D'altra parte se la nucleasi usata è specifica si nota solo un effetto transitorio sulla proliferazione cellulare. Tale effetto sembra essere completamente reversibile e compatibile con il mantenimento di importanti proprietà biologiche delle cellule staminali ematopoietiche”.
La ricerca condotta nei laboratori dell'Istituto San Raffaele Telethon di Milano ha goduto del supporto oltre che da parte di Telethon e dell’Ospedale San Raffaele, anche del Ministero della Salute Italiano, del Programma Human Frontier Science (HFSP), del Programma ATIP-Avenir (Inserm/CNRS, France), della French Cancer Research Association (ARC foundation, France) e di FIRC-AIRC per l'Italia. Si tratta di un lavoro di indiscusso valore, difficilmente riassumibile in poche righe e che prende le mosse non dai punti di forza di CRISPR ma dalle sue debolezze.
“Studi precedenti hanno messo in evidenza l’eventualità di selezionare mutazioni che inattivino p53 dopo la modifica, sottolineando così un possibile rischio di tumore associato a procedure di modifica genetica che potrebbe mettere a repentaglio il suo potenziale terapeutico” – afferma la dott.ssa Raffaella Di Micco, esperta dei meccanismi di regolazione della senescenza delle cellule ematopoietiche e che ha diretto lo studio – “Il nostro lavoro dimostra che le cellule staminali progenitrici ematopoietiche tollerano bene una o poche rotture del DNA, con l’attivazione solo transitoria di p53 e un impatto limitato sulla loro funzionalità, principalmente sulla manifestazione di proliferazione ritardata. Tuttavia, se disattiviamo transitoriamente la risposta di p53 durante l'editing genomico, possiamo contrastare questo effetto e migliorare la resa delle cellule modificate, senza un aumento del carico di mutazioni o dell’instabilità del genoma”.
“L’altra grande sfida dell’editing genomico nelle staminali progenitrici ematopoietiche è l’efficienza relativamente bassa della ricombinazione omologa, necessaria per introdurre la sequenza correttiva fornita dal modello di riparazione” – conclude Naldini – “Questo ostacolo è stato sostanzialmente superato dalle nuove tecniche descritte nei nostri e in altri lavori recenti”.
