Il futuro dell’editing in vivo dipenderà dai progressi del trasporto mirato, che permetteranno di trattare un numero crescente di malattie in modo più efficace e sicuro
Immaginate di lanciare un trilione di freccette e che tutte quante colpiscano il centro del bersaglio. Per raggiungere questo livello di precisione con l’editing genetico bisognerebbe veicolare in modo intelligente il macchinario molecolare per la correzione del DNA (CRISPR o una sua variante) nel corpo dei pazienti, introducendolo soltanto nelle cellule difettose e bypassando i tessuti sani. I vantaggi sarebbero molteplici: massima efficienza di intervento, zero sprechi, minori rischi in termini di tossicità, immunogenicità, mutazioni indesiderate. Come si può ottenere un targeting così mirato? Agendo su diversi livelli, spiegano su Nature Biotechnology Jennifer Doudna e tre ricercatori del suo Innovative Genomics Institute.
PRIMO LIVELLO: LA VIA DI SOMMINISTRAZIONE
Per portare a destinazione un correttore genetico (o le istruzioni genetiche necessarie per produrlo in situ) si usano dei vettori, ma questo non basta. Bisogna controllarne il tragitto, cominciando dal sito di immissione dentro al corpo umano. La modalità più semplice prevede di immettere questi trasportatori con il loro prezioso carico direttamente nel flusso sanguigno tramite somministrazione endovena. Il vantaggio è che si tratta di un atto non invasivo, lo svantaggio è che la gran parte della dose finirà negli organi deputati alla depurazione. Questo approccio, dunque, funziona bene quando si vogliono editare le cellule del fegato, mentre è poco consigliato per altri organi, proprio per la potenziale epatotossicità. La via endovenosa è già stata usata con successo nel caso di Baby KJ (il neonato con disturbo del ciclo dell’urea per il quale è stato sviluppato un trattamento su misura), nella sperimentazione clinica per l’amiloidosi da accumulo di transtiretina e in quella per l’ipercolesterolemia familiare. Altre applicazioni per cui è in via di studio vanno dall’angioedema ereditario all’epatite B.
Un altro distretto corporeo facilmente raggiungibile è l’occhio. Le iniezioni subretinali (sotto la retina) sono già state impiegate in fase sperimentale su pazienti affetti da amaurosi di Leber e ci sono test preclinici in corso per altri disturbi della vista, come retinite pigmentosa e malattia di Stargardt. Non si esclude la possibilità di iniettare i trattamenti anche in altri punti (camera dell’occhio, stroma, vitreo). Le iniezioni intracocleari, invece, sono utili per testare trattamenti per la sordità genetica. La somministrazione orale, com’è intuibile, è adatta a raggiungere le vie digestive, in particolare per cercare di contrastare i batteri antibiotico-resistenti dell’intestino. Mentre quella intrauretrale viene sperimentata contro le infezioni del tratto urinario. Al di fuori dai trial clinici vengono esplorate anche altre vie: iniezioni intramuscolari, nel midollo spinale, nella trachea e direttamente dentro alle masse tumorali. Molti distretti di interesse, purtroppo, non hanno punti di accesso diretto (il pancreas, ad esempio), perciò potrebbero essere necessari metodi più invasivi, di tipo chirurgico, praticabili solo in contesti specializzati.
SECONDO LIVELLO: CHIAVI E SERRATURE
Per favorire l’ingresso selettivo dei correttori di geni si può ricorrere al targeting molecolare attivo, progettando vettori come le particelle nanolipidiche coniugate in grado di legarsi a qualche molecola di superficie delle cellule bersaglio. Nel trial per l’ipercolesterolemia familiare, ad esempio, le goccioline di grasso usate come mezzi di trasporto sono dotate di un ligando (GalNAc) che riconosce un recettore molto espresso nel fegato ma non in altri tessuti. D’altro canto, i virus adeno-associati impiegati in altre sperimentazioni sono scelti in base al loro tropismo, ovvero alla loro capacità di farsi strada in cellule con determinati recettori (ad esempio il virus AAVrh74 somministrato endovena raggiunge i muscoli). Un’altra idea testata nei laboratori sfrutta le capacità di riconoscimento degli anticorpi coniugati (in questo esempio sono stati editati così dei linfociti T. Nel targeting molecolare passivo, invece, ci si affida alle caratteristiche intrinseche dei vettori come dimensioni e composizione lipidica per influenzarne la diffusione nel corpo. Mentre le particelle nanolipidiche neutre privilegiano il fegato, come sappiamo, quando i lipidi assumono una carica positiva tendono a concentrarsi maggiormente nei polmoni. Insomma, il secondo livello fornisce una strategia di arricchimento valida quando si riesce a individuare un meccanismo chiave-serratura specifico, ma non è capace di aprire tutte le porte.
TERZO LIVELLO: LIBERTÀ DI ESPRESSIONE
Un ulteriore livello di controllo può essere esercitato fornendo le istruzioni per produrre il correttore genetico direttamente dentro le cellule desiderate e facendo in modo che le altre cellule non possano farlo. Uno stratagemma consiste nell’utilizzare promotori tessuto-specifici, ad esempio per cellule muscolari o per neuroni. Dopo che le istruzioni genetiche sono state trascritte in RNA, poi vengono tradotte in catene proteiche. Dunque un’altra possibilità consiste nel controllare la traduzione attraverso l’uso di elementi regolatori come i microRNA. Entrambe le strategie, comunque, hanno dei limiti (la specificità di espressione, ad esempio, può avvenire a spese della quantità).
QUARTO LIVELLO: SEQUENZE SPECIALI
Se l’editing riguarda un gene che è espresso solo in un certo tipo di cellule (ad esempio il gene PCSK9 nel fegato) le correzioni effettuate su cellule diverse non avranno effetto, perché il gene lì è spento. Se poi CRISPR viene usata per tagliare via le sequenze virali che si sono integrate nel genoma, troverà il suo bersaglio solo nelle cellule infette (il riferimento è a una sperimentazione contro l’HIV). A livello preclinico, una strategia simile è stata sperimentata per mettere ko le mutazioni oncogene, al fine di uccidere le cellule cancerose senza intaccare i tessuti sani, anche se la strada verso questo tipo di intervento è ancora in salita. Alternativamente, si può pensare di guidare l’attività del correttore con interruttori attivati da molecole e persino dalla luce. In generale, comunque, puntare sulla specificità delle sequenze è un po’ l’ultima ratio.
VERSO UN FUTURO DI PRECISIONE
L’ideale sarebbe combinare diversi livelli di controllo, perché è probabile che nessuno da solo sia sufficiente a prendere la mira in modo perfetto nei diversi tessuti e stadi di malattia. “Finora i rapidi progressi relativi ai correttori genetici hanno superato la nostra capacità di veicolarli in modo sicuro ed efficace verso specifiche cellule nel corpo”, scrivono Doudna e collaboratori. La convinzione è che gli avanzamenti in questo campo contribuiranno a rendere i trattamenti di editing meno costosi e allargheranno il ventaglio delle malattie a cui sono applicabili. “Miglioramenti nel targeting dei polmoni e delle cellule ematopoietiche e immunitarie probabilmente definiranno la prossima ondata di terapie”, concludono i ricercatori. La complessità del corpo umano richiede che biochimici, biologi molecolari, biologi cellulari, bioingegneri, chimici, scienziati dei materiali e clinici collaborino intensamente per costruire un futuro in cui le frecce di CRISPR riusciranno ad andare tutte (o quasi) a bersaglio.