I ricercatori hanno realizzato la mappa generando mutazioni mirate nei geni e verificando come cambia il fenotipo delle singole cellule di conseguenza
Il DNA umano contiene più di 20.000 geni codificanti, ma sono molti di più quelli che non vengono tradotti in proteine. Ma quale è la funzione di ogni gene e quali reti di regolazione genica sottintendono alla patogenesi delle malattie? Per orientarsi nel mare magnum del genoma, i ricercatori realizzano “mappe” che correlano il profilo genetico di una cellula (genotipo) alle sue caratteristiche morfologiche e funzionali (fenotipo). Un esempio recente è quella messa a punto dagli scienziati del Whitehead Institute for Biomedical Research, che combina due approcci: il sistema CRISPR/Cas9 per introdurre mutazioni in punti precisi del genoma e il sequenziamento a singola cellula per analizzare il fenotipo corrispondente. Il risultato, pubblicato su Cell, è una mappa ad alta risoluzione che assegna a ogni gene il proprio compito e chiarisce anche l’origine dei fenotipi più complessi.
GENETICA DIRETTA E INVERSA
Il metodo migliore per studiare la funzione di un gene è modificarne l’espressione e vedere come cambia il fenotipo della cellula quando il gene è assente, o al contrario, sovraespresso. Esistono due tecniche, opposte ma complementari, per studiare come si comportano i geni.
La genetica diretta (forward genetics) cerca di determinare le basi genetiche di un fenotipo (ad esempio una malattia). Al contrario, la genetica inversa (reverse genetics) studia quale fenotipo è associato a una particolare sequenza genetica. Per studiare il ruolo di una mutazione, ad esempio, la si introduce in un modello cellulare o in un organismo animale per ricreare il fenotipo.
LA RIVOLUZIONE CRISPR
I progressi nella biologia molecolare e nell’ingegneria genetica hanno contribuito a espandere il repertorio di tecniche per gli studi di genetica, diretta e inversa. Uno, in particolare, ha completamente rivoluzionato il settore: CRISPR/Cas9, uno strumento di editing genetico che usa la proteina Cas9 (una sorta di forbice molecolare) e un RNA guida (che funziona da bussola) per modificare i geni in maniera mirata.
Nel caso della genetica diretta, CRISPR ha sostituito i mutageni chimici o le radiazioni, che introducono mutazioni random, e ha permesso invece di generare librerie di mutazioni in punti precisi del genoma. Inoltre, ha contribuito a produrre nuovi modelli animali con mutazioni specifiche per gli esperimenti di genetica inversa.
Questi esperimenti, però, sono spesso condotti su piccola scala, su pochi geni selezionati o su fenotipi noti. La maggior parte prende in considerazione solo fenotipi “semplici”, come la presenza o assenza di marcatori di crescita o espressione, escludendo i geni che hanno meccanismi di azione diversi. I risultati sono poi interpretati come una “media” dei fenotipi osservati su un insieme di cellule con un certo gene silenziato o sovraespresso. A volte, però - spiegano i ricercatori del Whitehead Institute for Biomedical Research - cellule che hanno perso lo stesso gene si comportano in modo diverso, e queste differenze si perdono facendo semplicemente la media.
UNA MAPPA COMPLETA
I ricercatori hanno quindi usato una tecnica che si chiama Perturb-seq per creare la prima mappa di correlazione genotipo-fenotipo, che assegna a ogni gene la propria funzione su scala genomica. Questo metodo unisce lo strumento CRISPR/Cas9 e il sequenziamento dell’RNA a singola cellula (RNA-seq), che consente di estrarre e analizzare l’informazione genetica contenuta in una sola cellula. Gli scienziati hanno generato con CRISPR una libreria di mutazioni in tutti i geni espressi in più di 2,5 milioni di cellule umane. Con l’RNA-seq, invece, hanno “fotografato” i geni attivi in ogni cellula – cioè quelli trascritti in RNA per poi essere tradotti in proteine.
Il risultato è una mappa multidimensionale che mette in relazione le modificazioni genetiche e il comportamento di ciascuna cellula nel suo microambiente. Rispetto ad altre tecniche di mappatura, questa richiede un minore numero di cellule e permette di studiare anche fenotipi complessi, poiché non si limita a misurare soltanto le differenze nell’espressione genica. L’RNA-seq a singola cellula è una miniera di informazioni che riguardano aspetti molto diversi della biologia cellulare, come lo splicing (il processo di maturazione dell’RNA messaggero), la progressione del ciclo cellulare o l’espressione di elementi trasponibili (segmenti di DNA capaci di spostarsi in diverse posizioni del genoma).
FUNZIONI VECCHIE E NUOVE
La mappa ha confermato migliaia di interazioni note tra i geni, mettendo insieme reti metaboliche o di regolazione genica. Ma ha anche permesso di assegnare nuovi ruoli a geni associati alla trascrizione, alla respirazione cellulare o alla sintesi dei ribosomi e di studiare fenotipi complessi, misurabili solo sulle singole cellule.
Uno di questi è l’aneuploidia, termine che indica una variazione nel numero dei cromosomi rispetto a quello normale che caratterizza la specie. Il fenomeno è comune nelle cellule tumorali, che spesso presentano la perdita o il riarrangiamento di interi cromosomi. I ricercatori sono riusciti a mettere in relazione le “perturbazioni” genetiche con anomalie nel numero dei cromosomi, assegnando a ogni mutazione un punteggio CIN (che significa chromosomal instability). Questo metodo ha permesso di identificare numerosi geni associati all’instabilità cromosomica, che determinano una segregazione difettosa dei cromosomi durante la divisione cellulare.
La mappa ha contribuito a delucidare anche un altro aspetto, ovvero l’interazione tra il DNA nucleare e quello mitocondriale in condizioni di stress. L’informazione genetica contenuta in questi organelli cellulari può produrre messaggi che modulano l'espressione dei geni custoditi nel nucleo della cellula. La scoperta di questo scambio di informazioni genetiche può avere ripercussioni sullo studio delle malattie causate da alterazioni nella funzione dei mitocondri.
Una limitazione? Il costo, che per gli screening basati sulla tecnologia CRISPR è ancora piuttosto elevato. I ricercatori hanno però utilizzato una tecnologia per il sequenziamento high-throughput, ossia l’analisi automatizzata di un numero molto grande di dati in tempi rapidi, a un prezzo competitivo rispetto a quello di altre piattaforme in grado di fornire lo stesso risultato.