Editing genomico: come prolungare l’effetto di CRISPR nella distrofia di Duchenne

Alcuni ricercatori americani hanno trovato il modo per abbattere una barriera all’applicazione di CRISPR/Cas9 estendendone gli effetti a lungo termine senza avere effetti off-target. La ricerca è stata condotta in topi modello per la DMD

Le distrofie muscolari sono un campo di ricerca molto prolifico nel quale hanno profuso sforzi enormi i ricercatori di tanti Paesi, dagli Stati Uniti alla Francia fino all’Italia. Di questo gruppo di malattie, a catalizzare l’interesse e le energie di tanti scienziati nel mondo è soprattutto la distrofia muscolare di Duchenne (DMD), una patologia degenerativa progressiva causata da mutazioni nel gene della distrofina.

Si tratta di un gene di grandi dimensioni e ad elevata mutabilità che codifica per l’omonoima proteina, senza la quale i muscoli dei piccoli pazienti – la Duchenne è una patologia che colpisce sin dalla nascita– si fanno più deboli, fino a che questi perdono la capacità di camminare, la funzionalità dei muscoli respiratori e del cuore. La distrofia di Duchenne è una patologia grave contro la quale il mondo della ricerca lotta da anni e non deve, quindi, stupire che anche l’editing genomico con CRISPR stia svolgendo una parte da protagonista in questo contesto.

CRISPR/Cas9 consente, tra le varie cose, di effettuare modifiche alla sequenza di DNA tagliando in maniera specifica la doppia elica e favorendo l’escissione di frammenti contenenti una o più mutazioni. L’idea di base dei ricercatori è stata quella di sfruttare specifici vettori virali adeno-associati (AAV) per veicolare i componenti dell’innovativa macchina molecolare all’interno dell’organismo così da consentire una sorta di “restauro” del gene della distrofina per avviare la produzione della proteina necessaria al buon funzionamento muscolare. Risultati incoraggianti erano già stati ottenuti su cellule di pazienti coltivate in vitro e, più di recente, su modelli murini in vivo. In quest’ultimo caso, tuttavia, l’efficacia della correzione non si è mantenuta per lungo tempo.

Da analisi più approfondite è stato possibile osservare che gli effetti del trattamento con CRISPR erano piuttosto limitati a livello della muscolatura scheletrica e cardiaca, senza miglioramenti sostanziali nella funzionalità del cuore. Come ben spiegato nell’articolo pubblicato sulla rivista JCI Insight , analisi più approfondite hanno messo in luce una sproporzione nella quantità di nucleasi Cas9 (usata per tagliare il DNA) e di gRNA (le molecole di “RNA guida” che hanno il compito di veicolare le Cas9 al punto di taglio desiderato). I ricercatori, infatti, avevano somministrato per via endovenosa ai topi di 6 settimane entrambi i componenti di CRISPR in proporzioni eguali ma, dopo 18 mesi, lo squilibrio tra le due componenti si era reso evidente. Ciò spiega i risultati ottenuti: CRISPR aveva lavorato bene nel periodo successivo alla somministrazione ma i suoi benefici non sono stati in grado di perdurare nel tempo in tutti i muscoli del corpo.

Con grande sorpresa, i ricercatori hanno osservato che la quantità di Cas9 era fino a 6-7 volte maggiore di quella del gRNA. Da ciò hanno dedotto che non vi fossero sufficenti copie di gRNA per indicare alle nucleasi Cas9 dove tagliare. Questo ha inficiato i risultati della sperimentazione. Perciò essi hanno approntato un nuovo protocollo che prevedeva la somministrazione delle componenti di CRIPSR in proporzione diversa, privilegiando le quantità di gRNA. Al momento dell’analisi dei risultati essi hanno potuto osservare un consistente miglioramento della funzionalità muscolare e cardiaca, legate ad un sensibile aumento nella produzione di distrofina.

“I nostri risultati spiegano come la perdita di gRNA rappresenti il solo ostacolo all’utilizzo di CRISPR quale terapia a lungo termine” – spiega il dott. Dongsheng Duan, dell’Università del Missouri, coordinatore dello studio – “Crediamo che incrementando e ottimizzando le dosi di gRNA potremo abbattere questo ostacolo. Tutto ciò non solo ci pone dinnanzi a interessanti possibilità terapeutiche per la distrofia muscolare di Duchenne, ma potrebbe avere implicazioni importanti nell’uso di CRISPR per un più ampio numero di malattie”.

I risultati di questo lavoro potrebbero quindi essere estesi ad altri filoni di ricerca ma non bisogna dimenticare che essi devono trovare conferma in ulteriori protocolli di studio. Per quanto riguarda la distrofia muscolare di Duchenne, tuttavia, le conclusioni che si possono trarre sono molteplici: innanzitutto, con il nuovo protocollo che prevede una somministrazione dei componenti di CRISPR sbilanciata a favore delle copie di RNA (i ricercatori sono giunti a un rapporto di 3:1) si osserva un ripristino della produzione di distrofina con un miglioramento della funzionalità muscolare e cardiaca, e una riduzione della fibrosi, tipica della patologia. Questi miglioramenti sono stati osservati fino a 18 mesi dalla singola somministrazione di CRISPR, un importante obiettivo nell’ottica di una possibile futura applicabilità nei pazienti, per i quali una riduzione delle infusioni renderebbe la terapia meno gravosa. Infine, gli scienziati americani non hanno osservato effetti “off-target” legati al trattamento, ovvero i tagli che possono essere indotti da CRISPR in punti indesiderati del genoma con effetti collaterali imprevedibili.Un risultato di grande spessore. La ricerca su CRISPR prosegue e taglia nuovi traguardi avvicinandosi sempre più alla clinica.

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