La natura offre un ricco repertorio di enzimi e i laboratori fanno a gara per perfezionarli. Ecco gli ultimi arrivati nella cassetta degli attrezzi per l’editing genomico
Dopo che Jennifer Doudna ed Emmanuelle Charpentier hanno inventato CRISPR, meritandosi il Nobel, altri ricercatori si sono dati da fare per reinventarla, sviluppandone nuove varianti che promettono di fare più cose e farle meglio. Una delle menti più creative impegnate in questa attività di riprogettazione molecolare è il ricercatore di origine cinese Lei Stanely Qi. Il suo laboratorio all’Università di Stanford è diventato una miniera di novità. Suo è stato il primo modello di CRISPR con le forbici disattivate deliberatamente, per trovare il bersaglio senza tagliare (dCas). Sua è anche l’ultima arrivata: una Cas miniaturizzata per poter entrare più facilmente nelle cellule di cui si vuole modificare il genoma.
La versione classica di CRISPR utilizza la proteina Cas9 che ha il difetto di essere piuttosto ingombrante con oltre mille aminoacidi. Ma la famiglia di proteine a cui appartiene è numerosa e variegata. Il gruppo di ricerca di Qi ha deciso di puntare su una Cas presente in un archeobatterio, anche se questo enzima non è in grado di funzionare nelle cellule degli organismi superiori, che presentano un DNA più complesso e meno accessibile. La scelta è caduta sulla Cas12f perché è grande meno della metà della Cas9 e quindi è più facile da trasportare dentro alle cellule da trattare. Le difficoltà di trasporto, infatti, sono uno dei punti deboli dei trattamenti di terapia genica a base di CRISPR.
Per trasformare la Cas12f in uno strumento biotech utile, però, è stato necessario modificarla ripetutamente, studiando la sua struttura tridimensionale e poi provando a cambiare un pezzetto per volta finché le cellule non sono diventate fluorescenti, a dimostrazione del fatto che l’esperimento era andato a buon fine. Questo certosino lavoro sperimentale è servito a valutare una quarantina di mutazioni, ha richiesto alla postdoc Xiaoshu Xu più di un anno e ha portato alla creazione della CasMINI, un gioiellino di appena 529 aminoacidi che è stato presentato all’inizio di settembre sulla rivista Molecular Cell. Un vero coltellino svizzero in miniatura, capace di editare il DNA a piacimento, seguendo le istruzioni della molecola guida di RNA, proprio come fa la sua sorella maggiore Cas9.
Per la prima volta, dunque, un enzima Cas che non funziona nelle cellule umane è stato reso funzionante in laboratorio. La CasMINI è stata messa alla prova in vitro, con successo, su diversi geni interessanti dal punto di vista terapeutico. Se anche gli esperimenti su modelli animali confermeranno i buoni risultati, queste forbici miniaturizzate potranno trovare posto nella cassetta degli attrezzi della terapia genica. Inoltre, lo stesso tipo di riprogettazione molecolare potrà essere utilizzato su altri tipi di Cas, per ottimizzarne le performance come strumenti biotech.
Qi, dunque, si conferma come uno dei CRISPR designer più talentuosi, con una lunga sfilza di innovazioni chiamate dCas9 (dove la d indica la disattivazione delle forbici genetiche), CRISPRi (dove la i sta per interferenza), CRISPRa (attivazione), CRISPR-GO (genome organization), senza contare il suo sistema di imaging basato su CRISPR e l’applicazione antivirale soprannominata PAC-MAN.
Intanto, la scorsa settimana, Nature ha annunciato la scoperta di un’altra Cas naturale (Cas7-11) capace di tagliare in modo affidabile e preciso l’RNA. Il merito va a due scienziati del MIT, Omar Abudayyeh e Jonathan Gootenberg, già coinvolti nella scoperta di un enzima (Cas13) che una volta attivato riduce a brandelli l’RNA. Negli stessi giorni il principale rivale di Jennifer Doudna, Feng Zhang del Broad Institute, ha presentato su Science una classe di forbici genetiche basate sui trasposoni e dette OMEGA (Obligate Mobile Element Guided Activity), che sembrano essere gli antenati naturali del classico sistema CRISPR e le cui potenzialità nel campo dell’editing sono tutte da esplorare.
Come ha scritto tempo fa il CRISPR Journal nel numero speciale intitolato “Expanding the CRISPR Toolbox”, il successo originale della Cas9 di Doduna e Charpentier ha stimolato lo sviluppo di varianti omologhe, sorelle e persino distanti cugine, utili per la manipolazione di genomi, trascrittomi ed epigenomi. La continua scoperta di nuove forbici genetiche nel mondo microbico, e persino virale, e “il perfezionamento di queste macchine molecolari attraverso mutagenesi, screening e design razionale ha dato origine a una moltitudine di strumenti derivati da CRISPR che hanno potenziato e democratizzato l’editing genomico”.
Tutto questo lavorio in corso nei laboratori per migliorare specificità, efficienza e versatilità, è testimoniato dal fatto che, secondo un’analisi pubblicata su Nature Biotechnology, solo poco più della metà dei brevetti relativi a CRISPR riguarda le sue applicazioni pratiche dalla medicina all’agricoltura. L’altro 45% riguarda invenzioni per il perfezionamento della tecnologia stessa, che continua a crescere e diversificarsi soprattutto nei centri di ricerca statunitensi e cinesi.
