È possibile rilevare il DNA del Mycobacterium tubercolosis utilizzando la tecnica di editing genomico: questo potrebbe aiutare nella diagnosi e nelle risposte al trattamento
Un recente studio di diagnostica molecolare, pubblicato su The Lancet Microbe, aveva lo scopo di determinare se l’utilizzo di CRISPR per la rilevazione del DNA libero – cioè non all’interno delle cellule – del batterio che causa la tubercolosi potrebbe essere utile per diagnosticare la malattia e valutare la risposta alle terapie. È stato analizzato il siero prelevato da due coorti di pazienti in Eswatini e Kenya - sia adulti che bambini, anche con HIV - valutati per la tubercolosi. La tubercolosi resta una delle principali cause di mortalità per malattia infettiva a livello globale, specialmente per chi è affetto da HIV. Sviluppare nuovi metodi di analisi e test è fondamentale per la diagnosi e il monitoraggio del trattamento.
LA TUBERCOLOSI
La tubercolosi (Tb) è una malattia infettiva che si trasmette per via aerea attraverso le secrezioni respiratorie contenenti il Mycobacterium tubercolosis, anche noto come bacillo di Koch. È importante sottolineare che non tutte le persone che si infettano sviluppano la forma attiva, dato che la malattia può restare silente per anni: questa condizione è chiamata infezione tubercolare latente e colpisce un quarto della popolazione mondiale. Stando alle informazioni condivise dall’Istituto Superiore di Sanità, la Tb è ancora una della 10 principali cause di morte nel mondo e il maggior numero di casi si concentra nel Sud-Est Asiatico, nel Pacifico Occidentale e in Africa. In Italia, Paese a basso rischio, sono circa 4000 i nuovi casi notificati ogni anno.
Come riportato dal “Global Tubercolosis Report 2021”, il COVID-19 ha avuto un notevole impatto sulla malattia: è evidente un forte calo globale di diagnosi e trattamenti e questo ha portato a un aumento delle morti, stimato nel 2020 a 1,3 milioni di persone, a cui si aggiungono 214mila decessi tra le persone sieropositive. A livello globale, nel 2020, circa l'84% dei decessi per Tb tra le persone sieronegative e l'85% del totale combinato dei decessi per tubercolosi nelle persone sieronegative e sieropositive si è verificato nelle regioni africane e del Sud-Est Asiatico.
UNA DOPPIA INFEZIONE
Ma perché porre l’attenzione su tubercolosi e sieropositività? Perché, se infettate dal bacillo di Koch, le persone che risultano positive per l’HIV hanno un rischio 20-30 volte maggiore di ammalarsi di tubercolosi nella sua forma attiva (Dati ISS). Questo perché la combinazione delle due infezioni è letale: l’HIV, infatti, indebolisce il sistema immunitario che non è più in grado di difendersi contro il batterio. Per questo motivo la tubercolosi era ed è una tra le principali cause di morte tra le persone con HIV.
La diagnosi precoce è quindi fondamentale, anche se rimane complessa e dipende ancora ampiamente dai metodi microbiologici basati sull'espettorato che hanno prestazioni decisamente ridotte nei bambini piccoli e nelle persone che convivono con l'HIV. In questi casi la difficile raccolta del campione e l'immunosoppressione possono contribuire a campioni respiratori con un numero insufficiente di batteri per il rilevamento. Per migliorare la diagnosi e valutare la risposta al trattamento della tubercolosi, sono quindi necessari test rapidi e innovativi non basati sull’espettorato.
CRISPR ALLA RICERCA DELLA TUBERCOLOSI
Come spiegato nello studio, la rilevazione del DNA libero del patogeno che causa la malattia ha un potenziale per la diagnosi e la valutazione del trattamento, ma gli studi basati sulla tecnica della PCR hanno riportato una sensibilità diagnostica scarsa e altamente variabile. CRISPR può essere utilizzata per aumentare la sensibilità di rilevamento: il legame della guida a RNA con la sequenza bersaglio può essere utilizzato per amplificare un segnale, ad esempio usando una sonda fluorescente rilevabile dagli strumenti di laboratorio. Studi precedenti hanno evidenziato che il DNA batterico circolante si trova a concentrazioni molto basse, con conseguente scarsa sensibilità. Questo non è stato migliorato in questo studio, ma è stata ottimizzata la tecnica di estrazione del DNA e la processazione del campione.
Questa ricerca ha infatti valutato la sensibilità e la specificità diagnostica di un saggio a fluorescenza ultrasensibile basato su CRISPR - nel sistema di editing è stata utilizzata la proteina Cas12 - per rilevare il DNA batterico circolante in campioni di sangue di adulti e bambini, inclusi quelli affetti da HIV e quelli per i quali non era stata rilevata l’infezione con i metodi tradizionali basati sull’espettorato. I risultati nelle due coorti di pazienti sono stati buoni: sono stati identificati casi di tubercolosi microbiologicamente e clinicamente confermati nella coorte di adulti prevalentemente HIV-negativa di Eswatini con una sensibilità del 96% e una specificità del 94% e con una sensibilità dell'83% e una specificità del 95% nella coorte pediatrica. Nella coorte dei pazienti provenienti dal Kenya, CRISPR ha individuato tutti i casi di tubercolosi confermata e l'85% dei casi di tubercolosi non confermata, diagnosticati da reperti clinici non microbiologici. Le concentrazioni del DNA batterico circolante presente nel siero sono diminuite rapidamente dopo l'inizio del trattamento della tubercolosi, suggerendo il suo potenziale per il monitoraggio del trattamento dell’infezione.
La diagnosi precisa e tempestiva delle malattie infettive (ma non solo) è un prerequisito per un intervento terapeutico efficace e per la sorveglianza epidemiologica. I metodi diagnostici basati sulla rilevazione degli acidi nucleici sono tra i più sensibili e specifici, ma la maggior parte di questi test richiede attrezzature costose e personale qualificato. Come raccontato in un articolo pubblicato l’anno scorso su Nature Biomedical Engineering, CRISPR, ampiamente utilizzata in molteplici ambiti della ricerca, sta rivoluzionando anche il settore della diagnosi (ne abbiamo già parlato qui, qui e qui).
Questa piattaforma ha un forte potenziale per migliorare la diagnosi della tubercolosi nei casi in cui è difficile ottenere campioni di espettorato (ad esempio, casi di tubercolosi extrapolmonare, Tb pediatrica o associata all'HIV) e in cui la bassa conta dei bacilli potrebbe compromettere l'accuratezza dei test. Il nuovo approccio – sviluppato grazie ai fondi di molteplici enti e università statunitensi - risponde quindi a importanti esigenze cliniche non soddisfatte, necessarie per migliorare la diagnosi e la gestione dell’infezione. Pur avendo alcune limitazioni nella procedura, i punti di forza ci sono: saranno necessarie analisi future in gruppi di pazienti più ampi e con controllo negativo, ma l’applicazione di questa tecnica potrebbe avere un grande impatto in futuro.