Chymera

Grazie a questa nuova tecnica basata su CRISPR, gli scienziati possono modificare allo stesso tempo più siti nel genoma per indagare la loro influenza nei processi fisiologici della cellula

CRISPR ha rivoluzionato lo studio del genoma umano, ma a distanza di anni dalla sua scoperta è rimasta una sfida in sospeso: poter silenziare più geni – o più frammenti di essi – all’interno della cellula. Obiettivo dei ricercatori dell’Università di Toronto (Canada), guidati da Jason Moffat e Benjamin J. Blencow, era quello di scoprire come diversi geni interagiscano tra loro e come queste interazioni influenzino i processi fisiologici in condizioni normali e in condizioni patologiche. Per studiare le interazioni geniche, però, serviva uno strumento in grado di agire su più geni contemporaneamente, cosa che capita spesso nei casi di cancro e altre malattie. CHyMErA, di cui si è parlato a marzo su Nature Biotechnology, potrebbe essere la risposta a questa necessità.

Il genoma umano codifica per circa 20mila geni e molte caratteristiche individuali, incluse quelle legate ad alcune patologie, sono ereditate e determinate dalle variazioni genetiche nel genoma umano. Riuscire a modificare e/o eliminare l’espressione dei geni è un passaggio fondamentale per la ricerca biomedica, perché permette di capirne le funzioni. Il laboratorio del professor Jason Moffat, del Canada Research Chair in Functional Genomics of Cancer, tra i suoi ambiti di ricerca include l’editing mediato da CRISPR e l’uso di tecniche computazionali per analizzare profili genetici e identificare le interazioni tra coppie di geni che possono essere la causa di proliferazione tumorale. Il gruppo è stato tra i primi a usare CRISPR per inattivare i geni umani uno alla volta per poter indagare sulle loro funzioni. Nel suo studio, pubblicato sulla prestigiosa rivista scientifica Cell nel 2015, è stato utilizzato il sistema Crispr-Cas9, in cui gli RNA guida portano l’enzima di taglio Cas9 al sito di interesse per tagliare un frammento di DNA. Purtroppo, la modifica in più siti target non è contemplata in questa versione del sistema di editing genomico.

Con la collaborazione del professor Benjamin J. Blencowe, del Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, specializzato nello splicing alternativo [un processo molecolare naturale che avviene sul RNA messaggero nelle cellule e che permette di ottenere diverse proteine da un'unica sequenza genica di partenza, NdR], e alla ricerca di un metodo per raggiungere siti che non potevano essere facilmente presi di mira con Crispr-Cas9, Moffat ha iniziato a cercare un enzima Cas con le caratteristiche adeguate.
Inizialmente è stato creato un RNA guida ibrido, cioè che al suo interno contiene le informazioni per più di un RNA guida. Cas 9 è stata combinata con Cas12a, in grado di tagliare sia il DNA che l’RNA: questo significa che può agire sull’RNA guida ibrido e generare diversi RNA guida da una singola molecola. Questo permette di avere più guide, per più target, generate direttamente nella cellula. Cas12a ha anche permesso di aumentare il numero di siti a cui mirare rispetto al solo Cas9, raddoppiandoli, dato che le sequenze target sono diverse. Questo nuovo strumento per l’editing genomico multiplo è stato chiamato CHyMEra (Cas Hybrid for Multiplexed Editing and Screening Applications).

Il primo obiettivo sono state delle coppie di geni chiamati paraloghi, cioè geni originati dalla duplicazione di un unico gene nello stesso organismo, ad esempio i geni alfa-globina e beta-globina. Pur avendo una sequenza di DNA simile, questi geni sono difficili da cercare nel genoma. A causa della loro origine, si pensava che i geni paraloghi avessero ruoli simili nell’organismo, ma la funzione non poteva essere studiata con i metodi classici perché, silenziando solo uno dei due, l’altro poteva compensare la “perdita”. Dopo l’eliminazione di 672 coppie di paraloghi, quasi tutte presenti anche nel genoma umano, i ricercatori hanno scoperto che molte coppie erano coinvolte nella sopravvivenza cellulare con funzioni simili, ma altre avevano funzioni distinte. Questo è stato possibile grazie a un approccio computazionale basato sul deep learning (sistema che sfrutta algoritmi per un apprendimento automatico) e sull’utilizzo di librerie di dati, contenenti informazioni sui geni e sugli RNA guida di esseri umani e modelli murini.

Altra caratteristica importante ai fini degli studi sul cancro e sulla sopravvivenza cellulare è la capacità di questa nuova tecnica di tagliare frammenti ravvicinati e codificanti nello stesso gene, i cosiddetti esoni. Ne sono stati analizzati più di 2000 con CHyMErA e, di questi, oltre 100 sono risultati critici per la cellula.
La versatilità di questo nuovo strumento di editing genomico apre le porte alla genetica combinatoria per lo studio delle malattie complesse come il cancro, ma anche altre malattie genetiche e multifattoriali.

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